Principais Métodos de Coloração

A perfeita visualização dos micro-organismos e/ou das suas estruturas só é possível se, além da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do micro-organismo a ser avaliado. Duas técnicas são empregadas: a fresco (direto e sem coloração) e fixado e corado.

De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de metileno, cristal violeta e fucsina básica). Dentre todos os métodos existentes, aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de microbiologia são os métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.

A Fresco: As preparações deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas condições normais de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações: quando a morfologia fica distorcida devido aos processos de fixação e coloração, durante a verificação da motilidade, durante os processos fisiológicos (divisão celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo).

Entre Lâmina e Lamínula: Salina

Esta técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio líquido e fungos. A técnica consiste em gotejar com o auxilio de uma alça de platina, esterilizada, no centro da lâmina, uma gotícula da cultura a ser investigada. Ou um fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser analisado. Em seguida cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.

Hidróxido de Potássio (KOH): esta técnica é usada para pesquisa de fungos, proveniente de material biológico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A técnica consiste em colocar uma pequena amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina; suspender o material com uma ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a lâmina para acelerar o clareamento.

Exame de Campo Escuro: esta técnica é empregada para observar a motilidade de bactérias dificilmente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em atritar as bordas da lesão suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o exudato com a própria alça ou fazer um imprint com a lâmina e cobrir com a lamínula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente. Ou, se o material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A microscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.

Tinta da China (nanquim): esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido cefalorraquidiano e outros materiais permitindo destacar a cápsula deste fungo contra um fundo negro. A técnica consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano sedimentado ou uma amostra do meio de cultura líquido e ressuspender em uma gota de tinta da china fazendo um filme bem delgado entre lâmina e lamínula.

Fixados e Corados: as preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das bactérias, pois tornam mais fácil a visualização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do micro-organismo em relação às colorações diferenciais.

Coloração Azul de Metileno: esta técnica é utilizada principalmente na avaliação da morfologia de bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados as células são menores devido ao menor número de manipulações. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.

Coloração de Wright Giemsa: esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfregaços sanguíneos, para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para demonstrar inclusões intracelulares em esfregaços diretos, de pele ou mucosas. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.

Coloração de Gram: a coloração de Gram, descoberta há pouco mais de 100 anos por Hans Christian Joaquim Gram é utilizada com muita frequência para o exame microscópico direto de amostras e subcultivos, para demonstrar as propriedades tintoriais de todos os tipos de bactérias.
As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram negativas. A diferença básica entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celulares. A técnica consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e iodeto de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então, tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir as células.

As bactérias Gram positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e aparecem em azul escuro. As bactérias Gram negativas não são capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e são contra coradas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado corante de contraste e adquirem a coloração vermelha.
Coloração de Ziehl-Neelsen: esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo que é resistente a coloração. Para o corante penetrar na célula é necessário calor ou detergente. Uma vez coradas, as bactérias álcool-ácido resistentes resistem à descoloração, enquanto outras bactérias descoram com o álcool-ácido. A técnica consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina (aquecer 3 vezes), descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.

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