Imunoensaios: Ensaios Conjugados

Com o intuito de construir o conhecimento ao longo do texto a respeito de imunoensaios por ensaios conjugados, faz-se necessário primeiramente abordar no que consiste um imunoensaio. Entende-se por imunoensaio ensaios baseados nos princípios que os antígenos específicos irão estimular reações imunológicas bem específicas e de que as proteínas produzidas por essa reação, os anticorpos, possam serem usadas para a sinalizar a presença de um composto-alvo em uma amostra.

RADIOIMUNOENSAIO

Um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo. Tem como princípio: a quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não marcado na amostra. Pode ser competitivo ou por excesso de reagente.

  • Radioimunoensaio de fase sólida

Um dos reagentes é imobilizado nas cavidades de placas plásticas de micro titulação; as placas são sensibilizadas com antígeno ou anticorpo.

  • Radioimunoensaio direto de competição com antígeno marcado

Uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido; adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com a amostra em teste ou com as soluções padrão que contém concentrações conhecidas de um antígeno não marcado. Após um período de incubação remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

  • Radioimunoensaio de competição com anticorpo marcado

Uma quantidade fica do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação o anticorpo marcado que não se ligou a fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

  • Ensaio imunorradiométrico

Anticorpos monoespecíficos marcados são utilizados para quantificar o antígeno. Excesso de anticorpo na fase sólida. Dois sítios de anticorpo. Autorradiografia: utiliza emulsão radiossensível para registrar a distribuição espacial de isótopos radioativos em determinado tecido, célula, organela ou molécula, podendo localizar substancias, estruturas ou processos biológicos.

– Autoradiografia: Utiliza emulsão radio-sensível para registrar a distribuição de isótopos radioativos em determinado,tecido, célula, organela ou molécula. Técnicas: Immunoblotting, Dot-blot, Precipitados em gel, Imunodifusão, Imunoeletroforese e Imunofixação. Três etapas: 1. Aplicação da emulsão 2. Exposição 3. Revelação. Emulsão preparada com haletos de prata = brometos, cloretos, haletos. E exposição capta o decaimento dessas substâncias.

– Imunofluorescência: Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligar covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. A marcação do anticorpo pelo florocromo resulta em conjugado especifico em que se deve determinar a concentração da γ-globulina, relação fluoresceína/proteína e o título para determinação de atividade imunológica.

Obs.: Ac marcado deve ser purificado, para aumentar eficiência e evitar colorações não específicas.

  • Teste de imunofluorescência direta

Empregado na pesquisa e localização de Ag em células ou tecidos (por intermédio de um Ac específico marcado). Ac não ligado é removido por lavagens. O preparado observado em microscópio de fluorescência. Teste de elevada sensibilidade e especificidade, mas requer um conjugado para cada sistema. Principal aplicação: imunocitoquímica, pesquisa de Clamydia trachomatis, Treponema pallidum, estreptococos β-hemolíticos, etc).

  • Teste de imunofluorescência indireta: Empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade.

Para pesquisa de Ag: Incubação da célula ou tecido em que se queira pesquisar Ag com o Ac específico, após lavagem, a preparação é incubada com conjugado antiimunoglobulina produzida em outra espécie animal.

Para pesquisa de Ac: Ag padronizados são fixados em lâminas de vidro. Soro do paciente é diluído e incubado com Ag. Após lavagem, a preparação é incubada com conjugado fluorescente (anti-Ig marcada, se houver Ac no soro o conjugado reage com Ac específico para o Ag). Pode-se detectar Ig de determinadas classes e subclasses. Para pesquisa de IgM, pode haver falso positivo, pois o fator reumatóide é IgM e utiliza anti-IgM – quando a IgG se liga ao Ag, expõe novos sítios na porção Fc, aos quais IgM se liga – é necessário absorção ou separação do fator reumatóide. Teste de referência de muitas doenças.

Sistema avidinabiotina: Técnica de amplificação. Avidina (glicoproteína derivada da albumina) possui alta afinidade por biotina (vitamina do complexo B). Biotina contém domínio ativo que se liga a aminoácidos, portanto se ligar a Ac. Avidina pode ser satura com fluoresceína sem perder a afinidade pela biotina. Após reação Ag-Ac não marcado, biotina marcada com segundo Ac é adicionada (como muitas moléculas de biotina se liga ao Ac, há amplificação do sinal) e em seguida adicionado a avidina marvada com fluoresceína.

  • Microscopia imunoeletrônica: Identificação de Ac e Ag a nível ultraestrutural. Bastante similar à imunofluorescência. Pode-se utilizar controles positivos e negativos – por ser uma técnica que pode perder sensibilidade devido o processamento do material. Conjugado: moléculas elétron-densas.
  • Imunoenzimáticos: Baseadas na utilização de Ag ou Ac marcados com enzimas e permitem a detecção, quantificação e titulação de substâncias.

– Localização de componentes celulares.

– Medidas de pequenas concentrações de Ag, Ac ou haptenos.

– Detecção de imunoprecipitados.

Imunoperoxidase: Emprega mesmo princípio da imunofluorescência, com a diferença de que utiliza enzima em vez de fluorocromo. A enzima converte o cromógeno (substrato + doador de elétrons) em produto insolúvel (pode ser colorido) que precipita no sítio de reação (sendo visualizado ao microscópio óptico). Pode ser utilizada na pesquisa de Ac, como na imunofluorescência indireta.

– Enzimaimunoensaio: É um método quantitativo, em que a reação Ag-Ac é monitorada por medida da atividade enzimática. Vantagens: elevada sensibilidade; utiliza reagentes estáveis; pode ser adaptado a testes simples como a automação.

Homogêneo: não há necessidade de separação dos complexos Ag-Ac formados e dos não formados, pois a interação Ag-Ac que modula a atividade da enzima. Utilizada para molécula menores.

Heterogêneo: há a necessidade de separação pois a atividade da enzima não é modulada pela interação Ag-Ac. Utilizada para moléculas maiores.

Requisitos para a enzima: Alta atividade específica, Produto da reação estável, Fácil quantificação, Facilmente obtida na sua forma pura, Facilmente conjugada, sem perda da atividade, Preço acessível. A enzima mais utilizada é a PEROXIDASE.

Obs.: Quando o Ag apresenta atividade de peroxidase, pode-se utilizar outro sistema, como fosfatase alcalina.

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay): ENSAIO HETEROGÊNIO Princípio básico é a imobilização de um dos reagentes na fase sólida, enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do Ac. Após o desenvolvimento de cor, a determinação pode ser feita visualmente para resultados qualitativos, ou medindo-se a densidade óptica da solução, espectrofotometricamente.

Ensaio para anticorpos:

A) Método Indireto: Placas plástica são sensibilizadas com Ag, reage com Ac da amostra. Conjugado anti-Ig humana reage com Ac capturado. Reação é revelada com solução cromógena (reação é interrompida e a intensidade de cor é estimada a olho nu ou fotometricamente). Vantagens: utiliza um único conjugado para diferentes sistemas; determinação de Ac de classes diferentes.

B) Método de captura para anticorpo IgM: Fase sólida é sensibilizada com anti-IgM específico para região Fc. Soro teste é incubado, havendo a captura de qualquer IgM da amostra. A seguir, incuba-se com Ag marcado ou não marcado, seguido de Ac específico marcado. Detecção de IgM pelo método indireto pode haver resultado falso positivo devido à presença simultânea de Ac IgG e fator reumatóide, que pode reagir com conjugado anti-IgM. Pode ocorrer, também, falso negativo se houver excesso de IgG, que competirá pelos sítios de ligação com maior afinidade.

Ensaios para antígenos:

A) Método de captura: Fase sólida sensibilizada com anticorpo específico. Amostra teste incubada com fase sólida. A seguir, incuba-se com excesso de Ac específico marcado. Revela-se com adição do substrato (taxa de degradação é proporcional à concentração do Ag).

B) Método de competição com antígeno marcado: Placas sensibilizadas com Ac específico. Incuba as placas com conjugado Ag-enzima e amostra (ou padrão). Após obtenção do equilíbrio, lava-se e incuba com solução do substrato da enzima. Reação é interrompida e faz a leitura, espectrofométrica (relação inversamente proporcional à concentração de Ag).

C) Método da competição com anticorpo marcado: Ag é ligado à placa e a ligação do Ac marcado é competitivamente inibida pelo Ag da amostra (ou padrão). Demais etapas semelhantes às método da competição com anticorpo marcado e densidade óptica também é inversamente proporcional.

D) Método da inibição para haptenos: Placas sensibilizadas com haptenos. Incubadas com amostra (pesquisa de haptenos) e Ac contra hapteno. Após lavagem adiciona anti-Ig marcada com enzima, ao mesmo tempo executa um teste sem hapteno e a diferença da absorbância na amostra e na referência reflete o nível de hapteno.

EMIT (Enzyme-multiplied immunoassay): Ensaio homogêneo. Ocorre inibição da atividade enzimática após a ligação Ag-Ac.

SLFIA (Substrate-labeled fluorescent immunoassay): Ensaio homogêneo. O sistema revelador é a fluorescencia; quanto maior a fluorescência, mais hapteno havia na amostra.

  • Quimioluminescência: Fenômeno em que se obtém energia luminosa a partir de uma reação química. A energia química gerada como resultado da dissociação de ligações fracas produz compostos intermediários em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao estado de energia inicial, emitem luz. Detecção antígeno-anticorpo utilizando enzima e uma molécula, que atuará como substrato e emissor de luz. Muitas variações da técnica – luminol, acridina, indol.
  • Turbidimetria: Método de medida da diminuição da intensidade da luz transmitida, em relação a incidente, através de uma suspensão de partículas, devido à reflexão, absorção ou espalhamento. As leituras são feitas em unidades de absorbância, que reflete a relação entre a luz incidente e a transmitida. Duas leituras: Uma antes de colocar o anticorpo, outra depois. Medida cinética: Realizadas leituras constantes, durante a reação. Limitação da técnica: Amostras turvas.
  • Nefelometria: Método direto de medida do espalhamento, em um determinado ângulo, de uma luz incidente por partículas em suspensão, sendo uma técnica sensível para quantificar as reações de precipitação entre antígenos e anticorpos. A quantidade de complexo formado pela reação antígeno-anticorpo, quando há uma concentração constante e em excesso de anticorpo, se vai adicionando antígeno, depende diretamente da concentração do antígeno e é caracterizada por uma curva parabólica.

Nefelometria de ponto final: Leitura feita no platô da reação. Tempo de incubação: 10 minutos a uma hora.

Nefelometria cinética: Monitoramento contínuo da reação. Mais rápido: 10 segundos ou 2 minutos.

Nefelometria X Turbidimetria: A nefelometria apresenta maior sensibilidade, enquanto a turbidimetria apresenta maior precisão e reprodutibilidade.

  • Citometria de Fluxo: Técnica que permite medidas rápidas em partículas ou células enquanto elas passam uma a uma através de um sensor, sendo as medidas realizadas em partícula de cada vez e não como valores médios da população total. Analisa eletronicamente os sinais gerados pelas células em suspensão, quando elas são interceptadas por um feixe de luz que pode ser um laser ou uma lâmpada de arco voltaico, que forneça comprimentos de onda específicos.

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